Por: Thomé, R., Bianchi, E.C., Arruda, Aguiar, P.R.

RESUMO
Fluidos de corte são compostos derivados de petróleo utilizados em indústrias com o intuito de adquirir uma perfeita lubrificação e refrigeração da peça em usinagem. Do ponto de vista biológico, são uma excelente fonte de nutrientes tornando esta emulsão alvo freqüente do ataque de microrganismos, que diminuem a vida útil do fluído de corte. Alem do gasto com a perda do óleo, recentemente estão sendo feitas associações entre o uso de fluido contaminado por bactérias e fungos com o surgimento de reações diversas nos operários expostos a eles.

Dentre elas a hipersensibilidade pulmonar e as dermatites. Os possíveis agentes etiológicos são, a micobactéria Mycobacterium immunogenum e fungos como Candida sp e Fusarium sp. Neste trabalho foram companhados os desenvolvimentos de bactérias do grupo das icobactérias e de fungos em geral enquanto ocorriam ensaios utilizando fluidos de corte minerais. Houve singelo crescimento fúngico, mas não foi constatado o crescimento de micobactérias. Possível resultado da não utilização de biocidas na emulsão, impedindo uma seleção sobre esses microrganismos.

INTRODUÇÃO
Fluidos de corte são compostos derivados de petróleo amplamente utilizados nas indústrias com o objetivo de obter refrigeração e lubrificação durante o processo de usinagem de peças metálicas, de soldagem, de torneamento entre outras atividades. Alem disso, conforme é utilizado, o óleo retira partículas e impurezas do material assim que o banha durante o processo (SILLIMAN et al. 1992).

Por possuir uma gama grande de nutrientes, o fluido de corte facilmente é contaminado por microrganismos que utilizam esses compostos como matéria prima em suas atividades fisiológicas. Conforme são liberados restos metabólicos no meio, ocorre corrosão de toda a maquinaria em contato com o óleo contaminado, incluindo nessa categoria a peça.

Dessa forma, o fluido contaminado sofre uma redução drástica de sua vida útil, uma vez que a degradação causada ocorre de forma acelerada.
Junto à essa perda do óleo e possível danificação das peças em contato com ele, as bactérias também estão sendo associadas ao surgimento de reações alérgicas nos operários expostos ao aerossol do fluido (MONICI et al. 1999).

Essas infecções tratam-se, na maioria dos casos, de dermatites causadas por fungos, alergias do trato respiratório por bactérias, e menos comum, aumento da mortalidade de diversos tipos de câncer (PARK et al. 2005, HEUTELBECK et al. 2004, GORDON et al. 2004, DILGER et al. 2005).

O fluido concentrado é tóxico às bactérias e fungos, devido à sua alta pressãoosmótica natural (KENNEDY et al. 1999, SILVA et al. 2000, MOORE et al. 2000,VEILLETE et al 2004). No entanto, para se adquirir um perfeito balanço entre aspropriedades lubrificantes e refrigerantes, os óleos são diluídos em água de torneira nas fábricas até que alcance concentração de 5-15%. Esse processo torna o fluido propício ao desenvolvimento de bactérias e fungos, principais contaminantes da emulsão (AWOSIKA et al. 2003, BECKET et al. 2005, BERNSTEIN et al 1995, GORDON et al. 2004). Tanto que, uma comparação feita entre os fluidos sintéticos, semi-sintéticos, emulsionáveis e integrais demonstrou que os óleos de corte preparados como emulsão são melhores que os demais para propagação de microrganismos (PARK et al 2005, CHANG et al 2004, FALKINGHAM et al 2003).

Para conter a degradação do fluido e garantir um aumento na sua vida útil são acrescentados aditivos na preparação da emulsão (biocidas, anti-espumantes, anti-corrosivos). Essas substâncias causam uma pequena perda na qualidade do óleo, e também criam uma falsa sensação de segurança, uma vez que após o uso de biocidas, foi constatado o desenvolvimento de micobactérias (PASSMAN et al. 2006, DILGER et al. 2005, FALKINHAM et al. 2003).

Com a escassez de dados sobre a relação entre micobaterias e fungos com o desenvolvimento de doenças respiratórias e dermatoses, esse trabalho tem por objetivo avaliar o crescimento desses microrganismos e se a adição de biocidas realmente auxilia na sua seleção sobre as bactérias gram – negativas, podendo assim, elaborar uma possível hipótese sobre o desenvolvimento da hipersensibilidade pneumática e a exposição dos trabalhadores aos aerossóis dos óleos de corte.

MATERIAIS E MÉTODOS
Coletas
Amostras de 15mL de fluido foram retiradas, do reservatório de uma retificadora que permaneceu em funcionamento por 136 dias sendo as coletas realizadas a cada dois dias.

As coletas se procederam da seguinte maneira: foram utilizadas pipetas descartáveis de plásticos com capacidade para 3ml. A cada coleta foram retirados 15ml de amostra do fluido de corte, que permaneceram estocadas em um tubo de plástico com fundo cônico com capacidade para 15mL (tubo Falcon). A concentração do fluído foi mensurada por um refratômetro de mão através da aplicação de uma gotícula da amostra, caso estivesse abaixo do esperado (5%), seria adicionado o volume de óleo de tal forma que atingisse o valor necessário, se a concentração estivesse acima do ideal, seria adicionado um volume de água até que o valor fosse atingido.

Medição das variáveis ambientais
Para a medição do pH, foi utilizado um pHmetro de mesa, que permaneceu ligado 24 horas/dia. No momento da coleta, o tubo Falcon com a amostra foi posto em contato com o eletrodo responsável pela quantificação de íon H+ dispersos. A temperatura foi obtida através de um termômetro acoplado a um relógio de mesa, que indicava a temperatura ambiente, a Umidade Relativa do Ar (URA), e a temperatura externa através de um fio prolongado (o termômetro), este foi posto em contato com o fluido de corte circulante no reservatório.

Análise do crescimento dos microrganismos

A amostra sofreu então um processo de descontaminação, que visava matar todas as bactérias, menos aquelas de interesse, no caso micobactérias. Existem diversas formas de descontaminação empregadas atualmente, mas acreditase que a proposta por Petroff (RIBEIRO et al 1993, BIER et al. 1990) é a mais eficaz, até mesmo porque é a mais utilizada e indicada. Ela consiste no tratamento da amostra com três soluções (A, B e C) descontaminantes.

A solução A é Hidróxido de Sódio com Vermelho de Fenol. A solução B é o ácido clorídrico 4%. E a solução C é neutralizadora. Para a descontaminação da amostra de fluido de corte, é necessário que seja seguido um procedimento específico. Cerca de 2mL da amostra coletada foram transferidos a um outro tubo falcon esterilizado por autoclavação, este também com capacidade de 15mL e fundo cônico. O mesmo volume da solução A foi adicionado no mesmo tubo.

O composto formado pela Amostra mais a solução A (A+A) foi agitado em Vortex de mesa por um minuto e imediatamente depois incubado em estufa a 37ºC, por quinze minutos. Passado o tempo de incubação, o composto A+A foi centrifugado por quinze minutos a 2000 rpm. Com a centrifugação todas as bactérias e fungos são depositados ao fundo do tubo Falcon, formando uma pequena região esbranquiçada, chamada Pellet, o restante do composto em suspensão é chamado sobrenadante.

O sobrenadante formado é retirado restando apenas o pellet ao fundo, sobre ele é adicionada a solução B, até que o composto A+B adquira a cor amarelo-tijolo, então é completado com solução C até que o composto final volte a cor rosa.

No momento em que o composto A+B+C adquirir a tonalidade rosa, pode-se supor que todas as bactérias foram mortas deixando apenas as micobactérias em suspensão. Dessa forma, 0,1mL foram retirados dessa amostra descontaminada e semeados em meio sintético específico para micobactérias, trata-se do meio Ágar Loweinstein- Jensen, em tubo de vidro. Então o meio foi colocado em estufa bacteriológica a 37ºC por 60 dias, e a cada semana foram feitas visualizações para conferir o possível crescimento, caso houvesse crescimento seriam feitas lâminas para exame microscópico das colônias.

Para conferir o crescimento fúngico, da amostra coletada do fluido de corte, estocada em um tubo falcon de 15mL, foram retirados 0,1mL e semeados em um tubo de vidro contendo o meio sintético Ágar Mycosel (BD SCIENCES), a escolha desse meio deve-se ao fato de que ele é acrescido de cloranfenicol, um potente bactericida utilizado em
remédios. Então o tubo foi mantido em estufa bacteriológica separada de bactérias, a 37ºC por 5 dias, tempo necessário para que sejam vistas macroscopicamente as primeiras hifas do organismo
Tratamento com biocida Depois dos ensaios de controle, foi realizado um ensaio com duração de 30 dias, onde foi adicionado microbicida
IPEL BP – 180 (IPEL) a uma taxa de 0,10% do volume total do reservatório. Esse biocida atua como um doador de formol, destruindo dessa forma a parede celular dos microrganismos. E assim como no ensaio de controle, os métodos para averiguar crescimento de microrganismos foram os mesmos.

Micro-cultivo das hifas fúngicas
Com os fungos que cresceram no fluido de corte, foi realizado um micro-cultivo. Resumidamente: cortou-se um cubo de formato quadrado de meio Mycosel estéril, com comprimento lateral de 2cm. Sobre este meio foi semeado a amostra fúngica, e antes do bloco de Mycosel ser levado à estufa ele foi posto sobre uma lâmina de microscopia e coberto por uma lamínula, e o sistema LÂMINA+MYCOSEL+LAMÍNULA) foi inserido dentro de uma placa de petri umedecida. Dentro da estufa ficou por três semanas, para que as hifas reprodutivas fossem visíveis. Após esse período a lamínula foi retirada e corada com solução Azul de Algodão 2%, e depois foi colocada em contato com nova lâmina de microscopia onde foi levada ao microscópio para análise microscópica das hifas que cresceram.

Suspensão celular
Para comprovar a eficácia do tratamento descontaminante sofrido pela amostra afim de semear micobactérias, foi preparada uma suspensão celular contendo diversos microrganismos, dentre eles o M.avium, uma micobactéria oportunista que ataca indivíduos imunodeprimidos. Brevemente: Cepas de Bacillus cereus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa e Mycobacterium avium foram unidas numa suspensão de salina a 9%, com volume de 1mL. Essa suspensão passou pelo tratamento previamente detalhado de descontaminação, e do composto final foram semeados 0,1mL sobre o meio Loweinstein-Jensen, que foi estocado em estufa a 37ºC por 60 dias.

RESULTADOS
Fungos
Os fungos, normalmente, levam cinco dias de incubação para que sejam notadas as primeiras hifas visíveis sobre o meio de cultura sintético. Por isso, cada amostra semeada ficava incubada a 37ºC por cinco dias e tinha seu crescimento checado. Mesmo após esse período, o meio era estocado em local limpo com temperatura ambiente por quinze dias, apenas para constatação de não crescimento. Durante os ensaios houve crescimento de hifas, apenas em algumas amostras, precisamente a partir da amostra quatro começaram a se desenvolver, confirmando a baixa concentração desses microrganismos no fluido de corte. Então essas hifas foram semeadas em Mycosel para posterior análise em micro-cultivo.

São poucos os dados que retratam somente os fungos em fluidos de corte na literatura. Esse resultado, no entanto, comprova a eficácia de semear a amostra no fluido diretamente sobre o meio sintético, descartando a necessidade de, ao contrário das micobactérias, fazer uma descontaminação.

Micobactérias
Durante o ensaio, não foi constatado crescimento de bactérias do gênero das micobactérias, talvez devido a uma competição sofrida com os demais espécimes de bactérias. No entanto, foi detectada a proliferação de bactérias Gram negativas, o que, de certa forma, é concordante com a literatura. Bactérias competem pelo mesmo substrato, por isso o desenvolvimento de algumas leva à inibição de outras.

Por não ocorrer crescimento de micobactérias, e afastar a hipótese de morte durante o processo de descontaminação, fizemos uma suspensão celular contendo micobactérias junto com outros tipos de microrganismos, também bactérias. Essa suspensão sofreu a descontaminação proposta por Petroff, e depois foi semeada em Lowesntein-Jensen.

Após 20 dias da descontaminação surgiram as primeiras unidades formadoras de colônias sobre o meio de cultura. Indicando que não houve falha na metodologia utilizada.

Tratamento com Biocida
O tratamento com biocida teve resultados imediatos. Logo após os primeiros cinco minutos de sua adição ao fluido de corte, não foram constatados bactérias ou fungos. E o mesmo continuou por mais quinze dias, até que a partir da sétima coleta foi possível observar o crescimento de hifas nos tubos com Mycosel. E essas culturas possuíam o mesmo aspecto das que cresceram sem a utilização de biocida. Com isso é possível inferir que o tratamento com biocidas leva a uma diminuição na viabilidade dos microrganismos que contaminam o fluido, contudo a eficácia do tratamento é reduzida conforme o tempo passa, e além disso os microrganismos que povoam novamente os fluidos de corte são os mesmos que o contaminavam antes da utilização deste aditivo.

Micro-cultivo
Foi realizado um micro-cultivo das hifas que cresceram para que fosse possível caracterizar microscopicamente os fungos que contaminam os fluidos de corte. Conforme mostram as figuras a seguir:

Fig 1: Colônia fúngica em tubo de Mycosel. Ao lado, Sistema utilizado no micro-cultivo (LÂMINA+MYCOSEL+LAMÍNULA)
dentro de uma placa de petri

Através do micro-cultivo, em conjunto com a análise das colônias macroscópicas, foi possível identificar os fungos que cresceram no fluído de corte. Conforme os tubos que continham crescimento foram separados, verificouse pelo formato das colônias de que se tratavam basicamente de duas espécies diferentes de fungos. Então comparou-se tanto os aspectos macroscópicos quanto microscópicos. Os fungos que contaminaram o fluido de corte durante esse período de experimentação e também a após a adição de biocida pertencem ao gênero Penicillium sp. devido a presença de hifas reprodutivas que aparentam o formato de pincel, de onde provem o nome do gênero. Embora ocorra uma diferenciação entre as porções macroscópicas das colônias, o exame microscópico nos demonstrou que ambos os tipos pertencem ao mesmo gênero, sendo portanto de espécies diferentes.

DISCUSSÃO
Fluidos de corte são compostos derivados de petróleo utilizados para lubrificação e refrigeração de máquinas e peças durante o processo de usinagem, seu uso é disseminado por todo o planeta, devido às suas vantagens. Eles impedem o superaquecimento gerado pelo atrito, o que garante melhor acabamento à peça, redução da força e energia necessária para o corte, além de prevenir a distorção (IRANI et al. 2005, WOSKIE et al. 2003).

De acordo com Gupta (2006), cerca de 1,2 milhões de trabalhadores são expostos aos fluidos de corte e seus aerossóis nos Estados Unidos. Caso fosse feito um levantamento em conjunto com outras nações, acredita-se que esse número seria significativamente maior. O óleo apresenta alguns problemas tanto para a indústria quanto para o trabalhador.

Um desses problemas acarretados pelo fluido de corte é sua contaminação microbiana. Que acontece como resposta ao alto poder nutritivo que esse composto apresenta a esses organismos. Uma vez que o óleo é um derivado de petróleo, em outras palavras, cheio de hidrocarbonetos, ácidos graxos, ésteres. Esses constituintes são utilizados por bactérias e fungos como matéria-prima a seu metabolismo.

Conforme a população fúngica e bacteriana cresce, o óleo perde gradativamente sua qualidade em desempenhar as funções de lubrificação e refrigeração acima mencionadas. Além de ter sua vida útil reduzida, para ser descartado o fluido precisa passar por um processo de tratamento, no qual sua agressividade ao meio ambiente é reduzida. Esse tratamento é oneroso à empresa.

Somado ao problema da diminuição da vida útil do óleo, os fluidos de corte estão sendo apontados como responsáveis pelo surgimento de diversos problemas à saúde do trabalhador (DILGER et al. 2005, GORDON et al. 2004 GORNY et al. 2004). Entre esses problemas podemos citar dermatites causadas por fungos, hipersensibilidade pulmonar causada possivelmente por micobactérias e o aumento de mortalidade de alguns tipos de câncer (PARK et al. 2005).

A Hipersensibilidade Pulmonar (HP) é uma doença do trato respiratório inferior (pulmões) que envolve uma reação imunológica frente a repetitivas inalações de antígenos (GUPTA et al. 2006, FISHWICK et al., 2005, KURUP et al., 2006., DAWKINS et al., 2006). Esses antígenos no caso são as micobactérias encontradas nos fluidos e suas endotoxinas (proteínas de parede celular). A HP se apresenta d três formas: aguda, subaguda e crônica. Sendo que esta última pode levar o indivíduo à morte por fibrose pulmonar (KURUP et al. 2006).

Os sintomas dessa doença incluem tosse, dispnéia, falta de ar, fadiga, mialgia e dores de cabeça, eles começam a surgir de quatro a seis horas após contato com o antígeno, contando que o indivíduo já esteja sensibilizado (ibid.). As bactérias patogênicas são em sua maioria intracelulares, dessa forma a resposta do organismo frente a essa ameaça se dará por reações imunológicas efetoras envolvendo células. Com micobactérias não é diferente (FALKINHAM et al. 2003).

Tomografias peitorais de pacientes que tenham adquirido HP ocupacional evidenciam a presença de grandes granulomas, que são concentrados celulares no local de infecção (BERNSTEIN et al 1995, BECKET et al. 2005). A formação do granuloma é um dos padrões de resposta imune celular contra patógenos intracelulares (ABBAS et al. 2005).

No entanto, dependendo do órgão afetado pelo granuloma, essa resposta pode ser prejudicial. Nos pulmões, por exemplo, manter um granuloma por muito tempo leva a fibrose pulmonar, ou seja, enrijecimento do órgão causando perda da função e consequentemente morte. Como conseqüência do infiltrado o operário apresenta diminuição da capacidade de difusão do CO2, diminuição do volume de ar inspirável e expectável (FISHWICK et al. 2005, GUPTA et al. 2006, FALKINHAM et al 2003, KURUP et al 2006, DAWKINS et al 2006). Fluidos de corte são causadores de HP através de providenciar a inalação de aerossol contaminado por fungos e bactérias ao trabalhador.

São poucos os relatos de HP ocupacional, Gupta (2006) afirma que o número de casos na realidade é maior, no entanto, a maioria das ocorrências é mascarada, uma vez que o médico que atende o indivíduo não faz uma associação entre a patologia com o local de trabalho. As espécies de micobactérias envolvidas com a hipersensibilidade pulmonar são Mycobacterium avium, M. terrae e M. immunogenum, todas essas espécies são encontradas na maioria dos ambientes (FALKINHAM et al. 2003), e, portanto são objetos de estudo deste trabalho.

A resolução dos sintomas dos trabalhadores se deu no momento em que eles foram retirados de seu local de trabalho, assim permitir que um operário que já teve HP volte a trabalhar diretamente com fluidos de corte é arriscado, pois as chances de a doença retornar são muito grandes (THOMÉ et al. 2007, GUPTA et al. 2006). Além disso, Gauthier (2003) pondera que algumas evidências indicam que uma exposição prolongada ao aerossol do fluido de corte pode levar ao câncer de pulmão. E além do problema com bactérias, os fungos também crescem em fluidos de corte, sendo responsáveis por problemas cutâneos no trabalhador. Van der Gast (2002) sugere que são as bactérias as causadoras da contaminação do fluido de corte por fungos, pois através de seu metabolismo, elas impedem o crescimento de outros tipos de microrganismos que sejam capazes de inibir o desenvolvimento fúngico. Dessa forma, os fungos seriam contaminantes secundários dos fluidos de corte. Fungos como Candida sp, Penicillium sp., e Aspergillus sp também causam outros tipos de HP, porém até o momento não foram relacionados aos fluidos de corte, apenas em situações de cultivos de cogumelos, e de outros fungos de interesse alimentício (KURUP et al 2006, ONO et al. 1985).

Apesar disso, esses organismos raramente causam infecções respiratórias, estando mais envolvidos com reações cutâneas, como dermatites, que podem ser profundas, ou superficiais. Uma das formas de dermatite, a micose, é mais conhecida (TRABULSI et al 2004). Esse problema tem gravidade menor em relação à HP, no entanto, conforme o operário continua seu trabalho, em condições precárias de higiene, ele pode transmitir o problema para seus colegas a partir do momento em que a extremidade corporal afetada entre em contato com o fluido de corte. Alias, um dos principais fatores de contaminação do fluido é a falta de higiene do operário frente ao fluido (PARK et al. 2005, EACHUS. 2006 GAUTHIER et al. 2003).

Outro meio de transmissão dos microrganismos é a água utilizada no momento da diluição do óleo concentrado. Falkingham (2003) afirma que micobactérias são encontradas principalmente em água, que são resistentes a altas temperaturas e crescem com facilidade em meios sintéticos com pouca oferta orgânica. Fungos, dificilmente sobrevivem em meios sem fonte de carbono, como a água, por isso podese afirmar que os fungos alcançam o fluido através do contato deste com a mão do trabalhador.

O corpo humano, em sua camada epidérmica, apresenta uma flora bacteriana e fúngica normal que não oferecem ameaças à saúde do trabalhador imunocompetente (isto é, que não apresenta qualquer desordem imunológica), pelo contrário, esses microrganismos nos protegem contra patógenos mais invasivos através da liberação de seus produtos metabólicos sobre a pele (TRABULSI et al. 2004).

Alguns fungos, como o Penicillium, possuem comprovadamente a capacidade de produzir metabólitos que inibem o crescimento de bactérias. Um desses metabólitos é a penicilina. No entanto, algumas espécies de Penicillium estão relacionadas com patogenicidades, como por exemplo P. marneffei. De acordo com Xi et al (2007), trata-se de uma espécie dimórfica, que tem crescimento tanto micelial como em forma de levedura, e é responsável por penicilliose na Ásia. Dificilmente a espécie que cresceu neste trabalho é a P.marneffei, nossos resultados indicam que os fungos que cresceram no fluido de corte não são patogênicos, uma vez que ao crescerem a 37ºC eles formam hifas, enquanto que ainda de acordo com Xi et al (2007) os fungos patogênicos têm formato de levedura a temperatura corporal. Existem relatos de que micobactérias crescem nos óleos de corte apenas, após a adição de biocidas no sistema.

Essa afirmação tem fundamento.

Micobactérias são resistentes ao uso de biocidas, em parte devido à capacidade destas em degradar alguns compostos do aditivo, como formaldeido, boratos, triazinas, fosfatos entre outros. Por serem resistentes, quando são adicionados microbicidas, as micobactérias são adicionadas artificialmente, através da eliminação de competidores por substrato (FALKINHAM et al 2003, EACHUS et al. 2006, PASSMAN et al. 2006, CHANG et al. 2004, BECKETT et al. 2005, KENNEDY et al 1999, VEILLETE et al 2004). Por isso realizou-se um ensaio em que um microbicida, a base de triazina, foi adicionado ao reservatório.

Embora seja um grave problema o crescimento de microrganismos nos fluidos de corte, até o presente momento não há no mercado tratamento completamente eficaz contra a contaminação. E ainda, o crescimento desses espécimes está diretamente relacionado com o surgimento de doenças tanto respiratória quanto cutâneas nos trabalhadores, acarretando uma perda financeira à indústria. Talvez, inocular o fluído com bactérias não patogênicas e que degradem compostos que não danifiquem muito o fluido é uma solução que pode acabar com os dois problemas de uma vez.

Mas até que sejam propostos tratamentos mais eficazes para o tratamento dos fluidos de corte contaminados, novos estudos devem ser conduzidos visando a caracterização da flora que contamina o fluido e que causa doença nos expostos.